Modificación del crecimiento y la expresión sexual en la Cannabis sativa.

Modificación del crecimiento
y la expresión sexual en la
Cannabis por medio de
aminoetoxyvinilglicina y etefón.

·H. Y. MohanRam y Rina Sett
·Departamento de Botánica, Universidad de Delhi-110007, India
·Recibido el 13 de agosto de 1981. Aceptado el 19 de noviembre de 1981

Resumen:

La aplicación apical de aminoetoxyvinilglicina (AVG) a plantas hembra (5, 10, 25, 50 y 75  microgramos (mcg) por planta) de Cannabis sativa indujo la formación de flores machos fértiles en las recién formadas ramas primarias laterales (RPL). Se comprobó que 1 mcg por planta no es efectivo y el tratamiento con 100 mcg resultó ser inhibidor. En el caso de tratamientos desde 5 a 50 mcg,las RPL produjeron flores machos, hermafroditas y machos con fertilidad reducida, mientras que con 75 mcg formaron sólo flores machos.Cuando se aplicó AVG (25, 50 mcg) a los ápices de las plantas macho rociadas con etefón (1920 · 1-1), el efecto de feminización causado por este último se redujo notablemente.

Palabras clave: Cannabis sativa,  aminoetoxyvinilglicina, etefón, reguladores del crecimiento, reproducción, inversión sexual.

Introducción
El etefón, un compuesto liberador de etileno (Abeles, 1973) aumenta la cantidad de flores hembra en las plantas de la familia de las cucurbitáceas (Mc Murray y Miller, 1963; Rudich et al., 1969, 1970; Augustine et al., 1973) e induce el crecimiento de flores hembra en las plantas macho de Cannabis sativa (MohanRam y Jaiswal, 1970). En dichas plantas, el ácido giberélico estimula la masculinidad (Peterson y Anhder, 1960; Wittwer y Bukovac, 1962). Se ha sugerido que la expresión sexual de la flor en la Cannabis es controlada por un balance
entre los niveles endógenos de etileno y giberélicos (MohanRam y Jaiswal, 1974). Existe evidencia de que el ion de plata es un potente inhibidor de la acción del etileno (Beyer, 1976) y que el ion de cobalto bloquea la síntesis del etileno (Beutelmann y Kende, 1977). Se ha demostrado que el nitrato de
plata y el cloruro de cobalto inducen flores macho en las plantas hembra de la Cannabis
(MohanRam y Sett, 1979; Sarath y MohanRam, 1979) y flores estaminíferas fértiles en plantas de una línea estrictamente
pistilada de Ricinuscommunis (MohanRam y Sett, 1980).
Recientemente, la aminoetoxyvinilglicina (AVG: L-a-amino-y-(2amino-ethoxy)-trans-β-ácido butanoico), un análogo estructural de la rizobitoxina ha demostrado inhibir la
producción de etileno (Bangerth, 1973; Baker et al., 1978; Amrhein y Wenker, 1979; Yu y Yang, 1979; Williams, 1980). La actual investigación se llevó a cabo para determinar el efecto de la AVG en la planta hembra de la Cannabis y también para investigar si es que el efecto del etefón puede o no ser invertido por medio de la aplicación de AVG.

Imagen 1

Figuras 1 – 5: Cannabis sativa: 1 a. 2 a: porciones finales de una
muestra de monitores hembra y macho, respectivamente,
x0.57. – 1 b muestra una flor hembra alargada, x2.3. – 2 b es una
vista agrandada de florescencia con flores macho y brotes, x1.6.
– 3: flores modificadas de plantas hembra tratadas con AVG (50
mcg), x5. – 3 a – c son flores intersexuales, cada una con una
bráctea característica, 3 d, e son flores macho menguadas y 3 f
es una flor macho completamente alterada (ver el texto para
más detalles). – 4 a: porción final de una planta hembra tratada
con 75 mcg de AVG. Nótese que el ápice seco (flecha) y dos RLP
largas producen flores macho inducidas en las puntas (foto
tomada 48 días después del tratamiento), x0.2. – 4 b: muestra
un agrandamiento de la porción final de una de las RLP, x0.7. – 5
a: porción final de una planta macho tratado con etefón (1920 mg
● 1-1) + AVG (50 mcg). Nótese el ápice seco (flecha) y las tres RLP
que producen algunas flores intersexuales y una gran cantidad
de flores macho (mf por la sigla en inglés) (foto tomada 35 días
después del tratamiento), x0.5. – 5 b: una vista agrandada de la
punta de una RLP, x1. (br= bráctea; mf = flor macho; RLP = rama
lateral primaria; st = estigma; sta = estambre; tp = tépalo).

Material y Métodos
Almácigos de Cannabis sativa creciendo de forma natural en el Jardín Botánico de la Universidad de Delhi (en diciembre 1979,
1980), fueron trasplantados durante la etapa de 3 o 4 hojas a maceteros de arcilla llenos con tierra de jardín. Debido a que el sexo de las plantas vegetativas es no es distinguible, fue necesario esperar hasta la aparición de las primeras flores para poder separar las plantas macho y hembra. Para cada experimento se seleccionaron plantas de altura prácticamente uniforme (24 a 30 cm), que presentaban 5 o 6 nodos de floración. Se aplicó una solución acuosa de aminoetoxyvinilglicina (Hoffmann-La Roche, Nutley, Nueva Jersey, E.E.U.U.) a los ápices principales de las plantas hembra con una pipeta de 0,1 ml. Se utilizó Tween 80 -polisorbato 80- (0,01%) como tensoactivo. Se aplicó una gota de 10 mcl de la solución de prueba diariamente en un cotonete colocado en el ápice por 5 días para aplicar la cantidad total. Al final del quinto día las plantas habían recibido 1, 5, 10, 25, 50, 75 o 100 mcg de AVG.
Las muestras de monitoreo sólo se les aplicó la solución de tensoactivo (Fig. 1 a, b). A las plantas macho se les aplicó en primer lugar dos rociadas en las hojas de solución acuosa
recién preparada de 1920 mg · 1-1 de etefón (2-ácido fosfónicocloroetílico, Agromore S.A., Bangalore) con un intervalo de siete días. Posteriormente, estas plantas recibieron una aplicación apical ya sea de 25 mcg o 50 mcg de AVG un día después de la segunda rociada de etefón. Se conservaron diez plantas para cada tratamiento. Un grupo de 10 plantas sirvió como muestra de monitoreo tratadas con etefón, además de
las diez plantas macho de muestra de monitoreo que no fueron tratadas (Fig. 2 a, b) las cuales recibieron sólo la solución
tensoactiva. La viabilidad de la germinación de granos de polen en las flores macho inducidas fue puesta a prueba por medio de
germinación en un medio con 7% de sucrosa y 1% de agar o por inmersión en una solución diacetato-sucrosafluorescina (2 mg de diacetatofluorescina disueltos en una gota de 10% de solución sucrosa) mientras se observaba la fluorescencia por medio de luz ultravioleta.

Resultados
Estudios en plantas hembra
La primera respuesta visible al tratamiento con AVG (menos de 1mcg) fue la decoloración del ápice y las hojas jóvenes. Con 5 y 10 mcgel meristemo apical no se vio afectado y el crecimiento del tallo principal se reanudo después de un corto plazo. El ápice murió en el caso de dosis más elevadas (25 – 100 mcg por planta). Las plantas que recibieron 5 a 100 mcg resultaron notablemente más pequeñas que las muestras de monitoreo y la reducción de la altura dependió de la dosis aplicada. Sin
embargo, no hubo diferencia en el aumento de la cantidad de nodos posterior al tratamiento con 5 y 10 mcg. No se produjeron nuevos nodos en las plantas que recibieron 25 o más mcg, pero si se presentó cierto crecimiento en la longitud debido a
elongación intermodal.
El tratamiento con 5 a 50 mcg de AVG causó la formación de flores hembra (♀, flor con un carpelo rodeado por una bráctea grande), flores intersexuales (♀ + ♂ flor que produce tanto carpelo como estambre Fig. 3 a – c), flores macho menguado (R ♂, flor que tiene 4 o menos estambres Fig. 3 d, e), y flores macho (♂, produce cinco tépalos y cinco estambres con una copiosa cantidad de granos de polen Fig. 3 f) en las recientemente formadas ramas laterales primarias (RLP). Los nodos que se desarrollaron en el eje principal, posterior al tratamiento con 5 y 10 mcg también produjeron flores de sexo
alterado, junto con flores hembra normales.
Los datos de la Tabla 1 indican que el porcentaje de flores de sexo alterado (♀, R♂, ♂) en cada rama lateral aumenta con la
cantidad de químico aplicado. Los datos sobre la cantidad de flores se tomaron a partir de las tres primeras RLP recientemente formadas, debido a que esa cantidad fue la mínima presente en todas las plantas tratadas , con excepción de aquellas que recibieron 75mcg (en las que sólo dos RLP se desarrollaron y estas fueron más grandes que las RLP formadas en respuesta a los otros tratamientos aplicados en las muestras de monitoreo). Es nteresante acotar que en plantas tratadas con 75 mcg de AVG, no se formaron flores intersexuales o flores macho reducidas y las ramas
produjeron flores macho totalmente alteradas con unas pocas flores hembra en los nodos basales (Fig. 4 a, b).

Tabla 1: efecto de la AVG en el crecimiento del brote, largo de las ramas laterales primarias (RLP) y la expresión del sexo de las flores en plantas hembra de Cannabis1).

imagen 2

1) Promedio de 10 plantas, 48 días después del tratamiento; CI intervalo de certidumbre a P ≥ 0,05; D ápice seco.
2) Porcentaje de flores de sexo alterado de la cantidad total de flores presentes en cada RLP.
3) Números indican posición desde la base hacia arriba.
– Indica ausencia de flores
*) Altamente relevante sobre muestra de monitoreo a P ≥ 0,01.
NS No relevante en relación a la muestra de monitoreo.

En plantas tratadas con 100 mcg de AVG, el eje principal no produjo nuevos nodos ya que el meristemo apical murió. Las hojas jóvenes se tornaron amarillentas y quebradizas. Sin
embargo, se registró un leve aumento en la longitud de los brotes como resultado de la elongación internodal. En la mayoría de las plantas tratadas no se desarrollaron nuevas
ramas laterales. De vez en cuando, se observaron una o dos RLP, pero su crecimiento fue limitado y la producción de capullos sucedió raramente. Las flores macho inducidas produjeron granos de polen viables
y 69% de ellas germinaron in vitro a los 30-35 minutos. Del mismo modo, posterior al tratamiento con diacetato fluorescina, los granos de polen viables emitieron fluorescencia al ser observados bajo luz ultravioleta.

Etapas de la masculinización

La primera etapa hacia la “masculinidad” fue el desarrollo de una amplia gama de flores intersexuales que produjeron tanto
carpelo como estambres (Fig. 1 c). Se observó la desaparición
gradual de los órganos asociados con la flor hembra tales
como, bráctea, ovario y lóbulos del estigma. A esto le siguió la
aparición de tépalos y estambres en las flores intersexuales. La
congregación de flores en cada nodo y la presencia de
pedículos representaban características adicinales de las
plantas macho.
Se puede concluir gracias a este experimento que la dosis
mínima efectiva de AVG es de 5 mcg y la cantidad óptima es 75
mcg por planta. Al utilizar 100 mcg, la AVG produce fuerte
inhibición del crecimiento.

Estudios en plantas macho

Debido a que el etefón provoca la producción de flores hembra e intersexuales en plantas macho de Cannabis (MohanRam y Jaiswal, 1970) y la AVG induce la formación de flores macho en plantas hembra (según lo demostrado en este informe), es lógico preguntarse si es que el efecto del etefón en las plantas macho puede ser revertido por medio de la aplicación de AVG.

Se seleccionó etefón a 1920 mg ● 1-1 porque MohanRam y Jaiswal (1974) habían demostrado que una cantidad máxima de nodos (5,2) produciendo flores hembra se forma en respuesta a dicha concentración. A pesar de que se presentó una leve epinastia dos días después de la primera aplicación con espray, los efectos característicos del etefón se presentaron después de dos días de la aplicación final. Las hojas presentes a momento del tratamiento presentaron epinastia, se tornaron amarillentas y quebradizas. La extensión de la epinastia fue inversamente proporcional a la edad de la hoja. Las hojas recientemente formadas fueron más pequeñas y verduscas en comparación a las de las muestras de monitoreo no tratadas. Se presentó una importante disminución en la altura y la cantidad de nodos en todas las muestras de monitoreo tratadas en comparación a las no tratadas. Las flores macho que ya estaban presentes se resquebrajaron. Se verificó el cese del crecimiento apical en todas las plantas de muestra tratadas con etefón por un periodo de 7 a 10 días. Las RLP presentes al momento de la aplicación con espray de etefón aumentaron en tamaño, dándole a las plantas una apariencia tupida. Sin embargo, no se desarrollaron nuevas RLP inmediatamente debajo del ápice en crecimiento. En las plantas de muestra tratadas, los primeros nodos en el eje principal produjeron flores intersexuales con morfología variada, mientras que los nodos formados posteriormente produjeron sólo flores hembra. Las plantas de muestra sin tratar continuaron produciendo sólo flores macho (Tabla 2).

Tabla 2: efecto de la interacción del etefón y la AVG en el crecimiento del brote principal, tamaño de las ramas laterales primarias y la expresión sexual de la flor1)

imagen 4

1) Promedio de 10 plantas 35 días después del tratamiento
2) Números indican posición desde la base hacia arriba
3) Porcentaje de flores produciendo sexo alterado del total de cantidad de flores
D Indica ápice dañado
+ No hubo presencia de laterales en esta posición
CI Intervalo de certidumbre a P ≥ 0,05
*) Altamente relevante en relación a la muestra de monitoreo a P ≥ 0,01

Las plantas que recibieron tratamientos de interacción no produjeron nuevos nodos en el brote principal y el pequeño aumento en su altura fue producto de elongación internodal. Las RLP se desarrollaron después de 15 – 20 días de la inhibición del crecimiento. Por lo menos tres RLP recientemente formadas se produjeron en todas las plantas que recibieron el tratamiento de interacción. Por lo tanto los datos se tomaron sólo de las primeras tres RLP. Como respuesta al tratamiento con 25 mcg de AVG, las ramas laterales produjeron flores intersexuales, hembras y macho, aunque la cantidad de flores hembra totalmente alteradas fue menor que la cantidad de flores macho normales. Le tomo menos tiempo a las plantas volver a producir flores macho que a las muestras de monitoreo tratadas. Curiosamente, no se observaron flores hembra completamente alteradas cuando se aplicó 50 mcg de AVG a plantas tratadas con etefón. Una gran cantidad de flores macho con unas pocas flores intersexuales se formaron en las RLP (Fig. 5 a,b). La Tabla 2 muestra una drástica reducción en el porcentaje de flores alteradas. Por lo tanto el efecto feminizante de 1920 mg ● 1-1 de etefón se puede reducir notoriamente por medio de un tratamiento con 50 mcg de AVG.

Discusión

El descubrimiento de la rizobitoxina (2-amino-4-2’-amino-3’-hidroxypropoxy-trans-3-ácido butírico), una fito toxina aislada de la bacteria del nódulo de la raíz (Rhizobiumjaponicum), y capaz de inhibir la producción de etileno en tejidos de frutas y otras plantas (Owens et al., 1971), impulsaron a investigadores a buscar sus análogos estructurales. La aminoetoxivinilglicina, uno de estos análogos, había demostrado ser un efectivo inhibidor de la producción de etileno en tejidos de manzana, rebanadas de tomate verde y palta (Lieberman et al., 1974; Baker et al., 1978) y haber cortado hojas de Petunia hybrida (Gavinlertvatana et al., 1980).

La AVG ha sido utilizada para retrasar la maduración de la fruta, reducir la caída antes de la cosecha y para aumentar la firmeza de la piel, etc. (Bangerth, 1978; Williams, 1980). Sin embargo, el efecto de la AVG en la expresión sexual de la flor ha sido estudiado sólo en dos cucurbitáceas. Loy et al. (1979) informó producción mejorada de estaminífero y flores perfectas en un melón reticulado genóico. En una línea genóica de Cucumissativus indujo flores perfectas (Atsmon y Tabbak, 1979). En la presente investigación se provocaron variados grados de masculinización en las plantas hembra de Cannabis posterior a la aplicación de AVG. Curiosamente, no se desarrollaron flores intersexuales en respuesta al tratamiento con 75 mcg de AVG y las ramas laterales produjeron flores macho de manera predominantes. Se especula que la AVG gatilla expresión sexual masculina en plantas hembra al impedir la síntesis de etileno. Mientras que el ácido giberélico causa elongación del brote además de inducir la masculinización en la Cannabis sativa (MohanRam y Jaiswal, 1972), la AVG (estudio actual) retarda la elongación del brote, pero promueve la expresión sexual masculina.

Es relevante apuntar que en plantas de Cannabis macho, la AVG (50 mcg) contrarresta notablemente el efecto de dos aplicaciones de espray de 1920 mg ● 1-1 de etefón y que las RLP recientemente formadas fallan en formar flores hembra totalmente alteradas. Ness y Romani (1980) han demostrado recientemente la reversión de maduración inducida por etileno de pera por medio de AVG. Aparentemente, la AVG es capaz de superar el efecto del etefón, ya sea bloqueando su estimulación de biosíntesis de etileno o por algún otro medio hasta el momento desconocido.

Texto traducido por: Claudio Jorquera Díaz , Traductor e interprete ingles español , jorqueraucinf@gmail.com

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